IDENTIFIKASI MIKROBA: METODE PEWARNAAN GRAM

Berikut ini adalah artikel keenam saya, dan kali ini saya akan membahas tentang identifikasi mikroba: metode pewarnaan gram. 

Apasih pewarnaan gram itu?

    Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Proses ini melakukan olesan bakteri yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk  membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini  dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarna air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Apasih perbedaan gram positif dan negatif?

Bakteri Gram positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika diwarnai dengan pewarnaan Gram. Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan Bacillus subtilis. Sedangkan Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna merah muda atau merah, kila diwarnai dengan pewarnaan gram. Contohnya Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

Macam-macam larutan yang digunakan dalam proses pewarnaan gram, yaitu larutan iodine, kristal violet, safranin, alkohol, dan aquades.

Apasih fungsi dan mekanisme kerja dari larutan-larutan tersebut?

 

  Iodine merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna coklat, dan asam. Mekanisme kerjanya adalah iodine yang banyak dan  kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif  sedangkan lipid dari sel organisme Gram negatif dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Senyawa penyusun dari iodin adalah larutan kalii (kalium iodin) dan (iodium).

 

   Kristal violet adalah zat warna yang memberi warna ungu merupakan pewarna primer atau utama yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Senyawa penyusun dari kristal violet adalah dimethylaniline, oksiklorida dan asam klorida. Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Kristal violet bersifat basa mengandung ion positif sehingga mampu berikatan dengan sel bakteri yang bersifat asam (bakteri gram positif) yang membuat dinding sel bakteri yang mengandung asam nukleat (protoplasma) berikatan dengan ion positif kristal violet dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).  

 

   Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder yang berwarna merah. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel - sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme. warna ungu dalam sel bakteri Gram negatif memudar maka akan digantikan dengan warna safranin yang sebagai pengganti warna primer (warna ungu), bakteri Gram negatif akan menyerap safranin dan menggunakannya sebagai warna bakteri tersebut. Senyawa penyusunnya yaitu safranin o, etil alkohol, dan aquades. Sifat kimiawi yaitu safranin bersifat asam yang mengikat sel bakteri Gram negatif  yang bersifat basa. Karena dinding sel bakteri Gram negatif tersusun atas lipid yang tebal, saat diteteskan alkohol lapisan lipid akan larut sehingga pori–pori dinding selnya akan terbuka lebar dan warna ungu kristal violet akan keluar selanjutnya pada pemberian safranin dinding sel bakteri Gram negatif menyerap warna merah pada safranin. Sifat fisiknya yaitu berwarna merah, tidak berasa dan tidak berbau.  

 

   Alkohol digunakan untuk membilas larutan zat pewarna primer. Alkohol bersifat asam basa dan tidak berwarna Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak berwarna. Mekanisme kerjanya adalah dekolorisasi yaitu ketika sel bakteri sudah menyerap atau melepaskan kristal violet (warna ungu) maka alkohol akan menghilakan warna yang tidak dibutuhkan oleh sel bakteri tersebut. Mekanisme dalam melarutkan lipid yang membuat permeabilitas dinding sel bakteri membesar dan menyebabkan warna sekunder (safranin) masuk dan terjebak diantara dinding sel dan lapisan membran sel bakteri Gram negatif. Alkohol bersifat merusak membran sel protein dari bakteri, sehingga terjadi denaturasi protein atau pengubahan struktur protein sehingga menjadi tidak aktif. Senyawa penyusun alkohol yaitu karbon, hidrogen, dan oksida

    Aquades  digunakan dalam metode pewarnaan gram untuk melunturkan warna utama yaitu Kristal violet sehingga dapat memperjelas pengamatan. Aquades dilakukan beberapa kali saat praktikum yang dimana setelah pemberian warna utama akan dibilas dengan dengan aquades kemudian diberikan dengan warna penguat selanjutnya dibilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan. Pembilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri. Ketika penambahan alkohol pada sel bakteri dilakukan kembali pembilasan dengan aquades agar membersihkan sisa alkohol pada bakteri dan saat penambahan warna sekunder dilakukan kembali pembilasan dengan aquades yang digunakan untuk membersihkan sisa safranin sehingga memperjelas pengamatan.